真菌装试剂时管要垂直
(2)测定
①微管柱的真菌制备：以少量脱脂棉作底用铁丝扎实，置于微管柱管架上，毒素的检依次加入高为0.5cm无水硫酸钠(80～100目)、真菌0.5cm硅镁型吸附剂、毒素的检0.5cm无水硫酸钠(80～100目)、真菌1.5cm中性氧化铝，毒素的检1.5cm酸性氧化铝、真菌3cm无水硫酸钠(40～80目)，毒素的检顶部以少量脱脂棉堵塞，真菌装试剂时管要垂直，毒素的检每装一种试剂要适当敲紧，真菌两种试剂之间界面要平齐，毒素的检柱管要随装随用，真菌以免在空气中吸水活性下降。毒素的检
②微柱色谱：在装好的真菌微柱中，加入三氯甲烷提取液1.0mL，同时做标准管，另取三支微管柱，各加入三氯甲烷1.0mL，再分别加入黄曲霉毒素B1标准液(0.1μg/mL)0pL、50μL、100μL，相当于黄曲霉毒素B1标准0ng、5ng、10ng，待加液流制顶层时，即加入1.0mL丙酮-三氯甲烷(1+9)展开剂，在加样或展开时，柱管均要保持垂直，待展开剂流完后，即可观察结果。
③结果观察与评定：于波长365nm紫外光灯下观察，将色谱分离后的样品管依次与0μg、5μg、10μng黄曲霉毒素B1标准管比较。若试样柱管内硅镁型吸附层与0管一致，则为阴性(在5μg/kg以下)；如试样管中硅镁型吸附层呈蓝紫色荧光环，则为阳性，并需进一步按薄层色谱法进行确证测定，但不需重新提取试样。其操作为：准确吸取原三氯甲烷提取液4.0mL(相当于4g或8g试样)于小蒸发皿内挥干，以少量苯-乙腈混合液(98+2)分数次转入刻度小管中，定容至1.0mL，密塞，混匀，按薄层色谱法确证，并测定黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G3、黄曲霉毒素G2的含量。
(三)高效液相色谱法
1、原理
试样经乙腈-水提取，提取液过滤后，经装有反相离子交换吸附剂的多功能净化柱，去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。净化液中的黄曲霉毒素以三氟乙酸衍生，用带有荧光检测器的液相色谱系统分析，外标法定量。
2、试剂和材料
①黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素岛、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G2的标准品，纯度＞99%。
②乙腈：色谱纯、分析纯。
③三氟乙酸：分析纯。
④ 己烷分析纯。
⑤ 水：电导率(25℃)≥0.01mS/m。
⑥ 乙腈-水(84+16)提取液：量取乙腈(分析纯)840mL，加水160mL，混匀。
⑦ 水-乙腈(85+15)溶液：量取乙腈(色谱纯)150mL，加三蒸水850mL，混匀。
⑧ 标准储备液：分别称取黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G20.2000g、0.0500g、0.2000g、0.0500g(精确至0.001g)，置10mL容量瓶中，加乙腈(分析纯)溶解，并稀释至刻度。此溶液密封后避光-30℃保存，2年有效。
⑨标准工作液：准确移取标准储备液1.00μL，至10mL容量瓶中，加乙腈(分析纯)稀释至刻度。此溶液密封后避光4℃保存，3个月有效。
⑩准系列溶液：准确移取标准工作液适量，至10mL容量瓶中，加乙腈(分析纯)稀释至刻度(含黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素Gl的浓度为0.00μg/L、0.5000μg/L、1.000μg/L、2.000μg/L、5.000μg/L、10.00μg/L、25.00μg/L、50.00μg/L、100.0μg/L；黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G2的浓度为0.00μg/L、0.1250μg/L、0.2500μg/L、0.5000μg/L、1.250μg/L、2.500μg/L、6.250μg/L、12.50μg/L、25.00μg/L的系列标准溶液)，注意避光。
3、仪器和设备
①液相色谱系统(HPLC)：附荧光检测器。
②色谱柱：反相C18柱，要求4种毒素的峰能够达到基线分离。
③含有反相离子交换吸附剂的多功能净化柱：MycosepTM226MFC柱或MycosepTM228MFC柱(或其他等效产品)。
④电动振荡器。
⑤漩涡混合器。
⑥烘干箱。
⑦离心机。
⑧真空吹干机，或氮气及水浴锅。
⑨天平：感量为万分之一。
4、分析步骤
(1)试样提取：称取20g经充分粉碎过的试样至250mL锥形瓶中，加入80mL乙腈-水(84+16)提取液，在电动振荡器上振荡30min后，定性滤纸过滤，收集滤液。
(2)试样净化：移取约8mL提取液至多功能净化柱的收集池中。
(3)试样衍生化：从多功能净化柱的收集池内转移2mL净化液到棕色具塞小瓶中，在真空吹干机下60℃±1℃吹干(或在60°C：水浴下氮气吹干，注意不要使液体鼓泡、飞溅)。加入200μL正己烷和100μL三氟乙酸，密闭混匀30s后，在40℃±1℃烘干箱中衍生15min。室温真空吹干机吹干(或室温水浴下氮气吹干)，以200μL水-乙腈(85+15)溶解，混匀30s，1000r/min离心15min，取上清液至液相色谱仪的样品瓶中，供测定用。
(4)标准系列溶液的制备：吸取标准系列溶液各200μL，在真空吹干机下60℃吹干(或在60℃水浴下氮气吹干，注意不要使液体鼓泡、飞溅)，衍生化方法同(3)。
(5)测定
①色谱条件
a．色谱柱 12.5cm×2.1mm，5μm，C18。柱温30℃。
b．流动相 乙腈(色谱纯)，水，梯度洗脱的变化参考下表。调整洗脱梯度，使4种黄曲霉毒素的保留时间在4～25min。
c．其他条件 流速0.5mL/min。进样量25μL。荧光检测器：激发波长360nm；发射波长440nm。
②测定：黄曲霉毒素按照黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的顺序出峰，以标准系列的峰面积-浓度分别绘制每种黄曲霉毒素的标准曲线。试样通过与标准色谱图保留时间的比较，确定每一种黄曲霉毒素的峰，根据每种黄曲霉毒素的标准曲线及试样中的峰面积，计算试样中各种黄曲霉毒素含量。
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